کلون کردن ترادف attb در پلاسمیدpsvm dhfr و حذف هدف دار در منطقه ی 3‘utr are از ژن ifnb در پلاسمیدpmi7 به منظور افزایش پایداری mrna و سطح ترجمه آن

اینترفرون ها پروتئین های نسبتاً کوچکی هستند که توسط اغلب سلول های جانوری در پاسخ به القا کننده های متنوع ترشح می شوند. اینترفرون انسانی به سه گروه تقسیم می شود: اینترفرون آلفا، اینترفرون بتا و اینترفرون گاما. اینترفرون بتای طبیعی یک گلیکوپروتئین 166 اسیدآمینه ای است که توسط اکثر سلول های بدن، در پاسخ به عفونت های ویروسی تولید می شود؛ و با اتصال به رسپتور سطح سلولی منجر به وقایع درون سلولی شده و باعث بیان ژن های القا شونده توسط اینترفرون می شود. اینترفرون بتا علاوه بر درمان ms، به صورت موثر در درمان سرطان، بیماری های خود ایمن و عفونت های ویروسی استفاده می شود. دو محصول اینترفرون بتای نوترکیب برای درمان بیماری ها استفاده می شود. یک فرم گلیکوزیله که دارای آمینواسیدهای طبیعی است و در سلول های cho تولید می شود. و فرم غیر گلیکوزیله که در e. coli تولید می شود. بیان زود گذر ژن اینترفرون بتای انسانی در پاسخ به القای ویروسی در سطح رونویسی و بعد از رونویسی تنظیم می شود. آزمایشات، دو عنصر ناپایدار کننده را در ژن اینترفرون بتای انسانی نشان داده است. یکی از این جایگاه ها در ناحیه ی انتهایی منطقه کد کننده ی ژن اینترفرون است و دیگری در ناحیه ی 3´utr قرار دارد. این دو بخش مکان اتصال کمپلکس ناپایدار کننده ی پروتئینی هستند. حذف هر کدام از بخش هامی تواند تولید پروتئین را افزایش دهد. سالیانی است که سلول های cho، به میزان زیاد برای تولید محصولات دارویی مثل اینترفرون بتا استفاده می شوند. تولید مداوم در این سلول میزبانی یک چالش بزرگ است؛ بنابراین سیستم نوترکیبی در جایگاه خاص phic31 می تواند برای الحاق پایدار پلاسمید در سلول های cho استفاده شود. با این روش پلاسمید به صورت پایدار در ژنوم الحاق می شود. این نوترکیبی برگشت ناپذیر است؛ و چندین جایگاه psedo-attp در کروموزوم های cho وجود دارد که مورد هدف آنزیم اینتگراز قرار می گیرد. بنابراین، این سیستم در جهت بیان مداوم پروتئین مفید می باشد. هدف اولیه در این تحقیق، الحاق ناحیه ی attb در پلاسمید psvm dhfr بود. به این منظور، دو پرایمر attbf و attbr با کمک نرم افزار oligo5، طراحی شد. با استفاده از این پرایمرها در طول یک واکنش pcr، ناحیه ی attb تکثیر شد. هدف بعدی حذف 53 نوکلئوتید، از 3´utr mrnaاینترفرون بتا در جهت افزایش پایداری mrna و کارایی ترجمه بود. این کار با تکنیک soeing pcr انجام گرفت. محصول واکنش pcr برای ساخت پلاسمید نوترکیب به کار رفت. پلاسمید ps-ifn?are از الحاق ژن اینترفرون بتای تغییر یافته در پلاسمید psvm dhfr ساخته شد. هردو پلاسمید در سلول هایe. coli xl1-blue ترانسفورم شدند. در مطالعات بعدی، به وسیله ی وارد کردن این پلاسمیدها در سلول های cho، پروتئین اینترفرون بتای انسانی گلیکوزیله به صورت پایدار تولید می شود و اثر قطعه حذف شده بر روی پایداریmrna بررسی می شود.